熒光原位雜交/FISH技術(shù)服務(wù)

    熒光原位雜交FISH的原理 ：熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

      雜交所用的探針大致可以分為三類：（1）染色體特異重復(fù)序列探針；（2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針；（3）特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物系標(biāo)記的dUTP(biotin-dUTP)經(jīng)過(guò)缺口平移法進(jìn)行標(biāo)記；而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。

服務(wù)流程

一、探針及標(biāo)本的變性
（1）探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

（2）標(biāo)本變性：

①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
二、雜交:
將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過(guò)夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。
三、洗脫：此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。
（1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。
（3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。
（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。
四、雜交信號(hào)的放大:
（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。
（2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。
（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。
（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。
（5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。
（6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。
（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
五、封片:
  可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。
六、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果:
先在可見(jiàn)光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)谖恢冒l(fā)出綠色熒光。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽(yáng)性，即使在末分裂的細(xì)胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號(hào)。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。