DNA熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法[1]。該技術(shù)具有快速、安全、靈敏度高以及探針可長期保存等特點，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)、基因定位、基因作圖、基因擴增,產(chǎn)前診斷及哺乳動物染色體進(jìn)化研究等領(lǐng)域。
　　
　　1FISH技術(shù)的產(chǎn)生
　　
　　1969年Gall和Pardue利用放射性同位素標(biāo)記的DNA探針檢測細(xì)胞制片上非洲爪蟾細(xì)胞核內(nèi)的rDNA獲得成功之后，Pardue等同年又以小鼠衛(wèi)星DNA為模板，利用體外合成的含3H的RNA為探針成功地與中期染色體標(biāo)本進(jìn)行了原位雜交，從而開創(chuàng)了RNA-DNA的同位素原位雜交技術(shù)[2]，但是沒有得到廣泛應(yīng)用。1974年Evans*次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，提高了基因定位的準(zhǔn)確性。1981年，Langer等采用生物素標(biāo)記的核苷酸探針(bio-dUTP)成功地進(jìn)行了染色體原位雜交，建立了非放射性原位雜交技術(shù)(Nonisotopicinsituhybridization)，至此，以熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞制片上進(jìn)行基因原位雜交的技術(shù)建立起來。1985年這項技術(shù)被引進(jìn)到植物。1986年，Cremer與Licher等分別證實了熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測染色體非整倍體的可行性，從而開辟了間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究。
　　
　　2FISH的原理
　　
　　熒光原位雜交技術(shù)原理是將DNA探針用生物素和毛地黃毒苷等熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異結(jié)合，通過熒光雜交信號來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對定量分析。與其他原位雜交技術(shù)相比，熒光原位雜交具有很多優(yōu)點，主要體現(xiàn)在：①FISH不需要放射性同位素作探針標(biāo)記，安全性高;②FISH的實驗周期短，探針穩(wěn)定性高;③FISH能通過多次免疫化學(xué)反應(yīng)，使其雜交信號明顯增強，從而提高靈敏度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交;④FISH的分辨率高達(dá)3-20Mb;⑤FISH可以用不同修飾核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針，再用不同的熒光素分子檢測不同的探針分子，因此可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時觀察幾種DNA探針的定位，直接得到它們的相關(guān)位置和順序，從而大大加速生物基因組和功能基因定位的研究。
　　
　　3FISH技術(shù)的發(fā)展
　　
　　在20世紀(jì)90年代，F(xiàn)ISH在方法上逐步形成了從單色向多色、從中期染色體FISH向粗線期染色體FISH再向fiber-FISH的發(fā)展趨勢，靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。
　　
　　3.1多色熒光原位雜交(M-FISH)
　　
　　多色原位雜交(M-FISH)，“M”分別代表“Multicolor”、“Multiplex”和“Multitarget”3種類型。M-FISH的zui大特點是：可將多次繁瑣的FISH實驗和多種不同基因的定位在一次FISH實驗中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(AFA)標(biāo)記探針建立了雙色FISH技術(shù)。1990年Nederlof等提出用3種熒光素探測3種以上的靶位DNA序列，創(chuàng)建了多色FISH方法。以下五種方法是在多彩色FISH基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)：染色體描繪(chromosomepainting)、比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)、光譜染色體自動核型分析(spectralkaryotyping,SKY)、交叉核素色帶分析(cross-speciescolorbanding,Rx-FISH)、多彩色原位啟動標(biāo)記(multicolorprimedinsitulabeling,multicolorPRINS)[5]。
　　
　　3.2DNA纖維熒光原位雜交技術(shù)(DNAfiber-FISH)
　　
　　Wiegant等和Heng等首先利用化學(xué)方法染色體進(jìn)行線性化，再以此線性化的染色體DNA作為載體進(jìn)行FISH，使FISH的分辨率顯著提高，就是zui初的纖維-FISH。Parra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)，F(xiàn)lorijn等(1995)，進(jìn)一步改進(jìn)了伸展DNA纖維的方法，使DNA纖維的伸展程度從zui初的80kb/μm達(dá)到了現(xiàn)在的2.5-3.5kb/μm，這一數(shù)值與Watson-Crick建立的DNA雙螺旋模型中B-DNA分子的理論值2.97kb/μm十分接近，因此可以說現(xiàn)在得到的DNA纖維基本上是裸露的雙螺旋DNA分子。纖維-FISH的關(guān)鍵就在于何制備高質(zhì)量的線性DNA纖維纖維-FISH具有高分辨率,能進(jìn)行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子(<10個)，靈敏度高等優(yōu)點由于纖維-FISH的這些優(yōu)點使得它在染色體圖譜繪制，基因重組研究以及臨床染色體基因序列檢測工作中起著十分重要的作用[1]。
　　
　　3.3組織微陣排列技術(shù)(tissuemicroarray)
　　
　　Microarray可以在1次實驗中檢測出數(shù)百個基因在1個細(xì)胞中的表達(dá)情況(包括降低和增高)。Tissuearray則在1次實驗中能檢測出1個基因在數(shù)百個細(xì)胞中的表達(dá)情況。Tissuemicroarray是由Tissuemicroarray區(qū)域中500-1000單個腫瘤組織聯(lián)合筒狀活檢構(gòu)成的，將活檢組織切成200多片用于DNA、RNA探針。單個雜交提供單個載玻片上所有樣本的信號，以后的切片可以用其他探針或抗體分析。同一個組織樣本切片的多重疊區(qū)域可以形成數(shù)千張切片。組織和cDNA微陣排列技術(shù)相結(jié)合提供一種有力的體內(nèi)鑒定基因的方法，可以對癌或其他疾病的分子改變做出重要評估。
　　
　　3.4熒光免疫核型分析和間期細(xì)胞遺傳學(xué)(fluorescenceimmunophenotypingandinterphasecytogenetics,FICTION)
　　
　　FICTION是1種將免疫核型分析和原位雜交相結(jié)合的方法，這種方法可以同時顯示異種細(xì)胞群中單個腫瘤細(xì)胞的免疫表型和一定的基因改變。FICTION形態(tài)學(xué)有關(guān)，可以對檔藏材料作回顧性研究。FICTION診斷快速，可以再現(xiàn)，適合FISH分析前或后沒有所需以前細(xì)胞標(biāo)本的細(xì)胞學(xué)樣本。FICTION可用于分析血液腫瘤的系譜以獲得對腫瘤病理組織更好的了解。
　　
　　4FISH技術(shù)的應(yīng)用
　　
　　FISH技術(shù)已經(jīng)在細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)、基因定位、基因作圖、基因擴增、產(chǎn)前診斷及哺乳動物染色體進(jìn)化研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
　　
　　4.1染色體結(jié)構(gòu)變異與非整倍體的檢測
　　
　　熒光原位雜交簡化了染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測。如植物染色體的非整倍體是由于染色體行為異常，即可能是雙親配子染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)差異引起或染色體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)等因素導(dǎo)致。利用原位雜交可比較容易地檢測出缺失、附加或替換的染色體。
　　
　　4.2基因擴增和缺失的檢測
　　
　　FISH空間分辨率和敏感性使得親本和擴增基因在抗病蟲害細(xì)胞中定位成為可能。被擴增基因主要在同一染色體臂上，但離初始親本基因有一定距離，且經(jīng)常獨立地位于染色體端粒部位;FISH分析表明細(xì)胞斷裂可能是由于染色體含有擴增區(qū)域的結(jié)構(gòu)重排。同時用FISH可定位轉(zhuǎn)基因植物中外源基因位置和拷貝數(shù)，此法在番茄、煙草、大麥、小麥、黑麥等作物中已獲成功。利用FISH技術(shù)也可檢測一些與遺傳性疾病相關(guān)的基因缺失，如成功檢測了aniridia疾病(一種虹膜缺失的罕見遺傳異常疾病)患者的缺失基因。
　　
　　4.3基因定位
　　
　　熒光原位雜交的基因定位技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。PP2Ac突變型肺癌相關(guān)基因在染色體區(qū)域的定位，熒光顯微鏡下觀察記錄和分析雜交信號的特征。結(jié)果在正常人淋巴細(xì)胞的染色體5q23-31可見明顯雜交信號，在GLC-82細(xì)胞的5號和7號染色體上出現(xiàn)較強信號。說明點突變引起PP2Ac活性改變，從而基因易位，導(dǎo)致肺腫瘤的產(chǎn)生。FISH技術(shù)與生化、計算機和重組DNA技術(shù)結(jié)合檢測Alu位點，表明DNA序列與帶型有關(guān)。用FISH技術(shù)對人類基因組中編碼基因分布的研究揭示，基因主要集中在染色體上G+C(占全基因組35%)zui豐富的DNA區(qū)段。FISH技術(shù)為著絲粒結(jié)構(gòu)研究提供了重要手段。應(yīng)用FISH技術(shù)可直接觀察染色體端粒，這簡化了染色體在核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能研究。
　　
　　4.4基因作圖
　　
　　用FISH技術(shù)可直接檢測DNA在染色體上的位置，所確定位置是基因在染色體上實際的物理位置。由于原位雜交不受位點內(nèi)變異和位點間拷貝數(shù)的影響，F(xiàn)ISH技術(shù)已成為重復(fù)序列和多基因家族作圖的重要手段，如M.Clark等用熒光原位雜交方法在大麥第5號染色體制作出B-醇溶蛋白位點的物理圖譜。多色探針標(biāo)記為探針定位提供了一種更簡便的方法。如檢測時2個探針用紅色，第3探針用綠色，則綠色位點的位置要么在2紅色位點之外，要么在它們之間，于是可確定探針順序。因此，探針被至少20kbp的序列隔開就可以用FISH技術(shù)將之定位。
　　
　　4.5產(chǎn)前診斷
　　
　　FISH技術(shù)zui先在美國用于產(chǎn)前診斷，早在1993年FISH技術(shù)就被美國遺傳學(xué)會(ACMG)允許用于產(chǎn)前輔助診斷，zui終的確診還需要依賴核型分析。而到2000年鑒于FISH技術(shù)具有高度的敏感性和特異性，ACMG宣布FISH技術(shù)可以用于常見染色體數(shù)目異常的確診，而不再僅僅作為輔助性產(chǎn)前診斷手段。在2001年，Tepperberg等對FISH技術(shù)進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的結(jié)果與核型分析結(jié)果進(jìn)行了大樣本比較，共47312份有效標(biāo)本中，F(xiàn)ISH法僅有9例出現(xiàn)了假陽性結(jié)果，假陽性率為0.019%，有32例出現(xiàn)了假陰性結(jié)果，假陰性率為0.049%。FISH進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷具有非常高的靈敏度和特異度，可以用于常見的染色體數(shù)目異常的診斷。此后，F(xiàn)ISH技術(shù)在一些發(fā)達(dá)國家被廣泛用于快速產(chǎn)前診斷。
　　
　　FISH適用于多種標(biāo)本：如羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞、胎兒有核紅細(xì)胞及著床前胚胎卵裂細(xì)胞等，且不僅適用于中期染色體，也適用于間期核及細(xì)胞周期的所有階段。FISH的突出優(yōu)點是可快速得出結(jié)果，與歷時7～12d的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行傳統(tǒng)染色體顯帶分析相比，F(xiàn)ISH可在24～48h內(nèi)完成，減少染色體病篩查試驗陽性患者在焦慮中的等待時間，讓臨床醫(yī)生盡早做出診斷，制定進(jìn)一步診療方案。與放射性原位雜交相比較，F(xiàn)ISH技術(shù)無放射性同位素污染，不需要特殊的安全防護，且敏感性與同位素檢測相當(dāng)，*可以取代放射性原位雜交而成為一種新的檢查方法。
　　
　　4.6染色體RNA和基因組進(jìn)化研究
　　
　　染色體的主要成分包括DNA和組蛋白，除此之外，還有非組蛋白和RNA。對這些物質(zhì)在染色體中分布進(jìn)行定位是研究染色體結(jié)構(gòu)和構(gòu)建染色體模型的關(guān)鍵所在。人們對染色體中DNA和蛋白質(zhì)研究已比較深入，但對染色體中RNA的性質(zhì)、種類、來源、分布特點及生物學(xué)功能缺乏深入研究。宋林生等[15]用生物素標(biāo)記的玉米18s、rRNA小麥5srRNA及tRNA的cDNA作為探針，利用玉米根尖超薄切片進(jìn)行原位雜交，證實玉米染色體中既有來自核仁的rRNA或其前體，又含有來自核基質(zhì)的rRNA、5srRNA或hnRNA(核內(nèi)不均一RNA)，揭示了染色體中RNA的種類和來源。
　　
　　4.7血液腫瘤檢測
　　
　　血液腫瘤是我國高發(fā)腫瘤之一，隨著對疾病發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遺傳學(xué)對腫瘤分型、診斷、治療和預(yù)測預(yù)后都具有重要的意義。在臨床上對血液腫瘤的FISH檢測主要集中在以下幾個方面：①染色體異位形成的融合基因檢測。②基因缺失的檢測。一些關(guān)鍵基因的缺失有助于我們對腫瘤進(jìn)行診斷以及預(yù)后判斷。③微小殘留病灶的檢測。④對異性間造血干細(xì)胞移植的植入狀態(tài)監(jiān)測。
　　
　　4.8在實體瘤中的應(yīng)用
　　
　　FISH幾乎可以快速檢測任何類型組織細(xì)胞的染色體異常，不管組織是新鮮的或是一些甲醛溶液(福爾馬林)固定的陳舊組織標(biāo)本。因此，F(xiàn)ISH被廣泛接受用于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、肺癌、淋巴瘤等實體瘤的輔助診斷，其目的主要集中在對腫瘤的早期診斷、療效檢測、個體化治療和預(yù)后判斷等幾個方面。
　　
　　總之，F(xiàn)ISH技術(shù)在臨床中的應(yīng)用已經(jīng)得到迅速的發(fā)展，靈敏度和特異度明顯改善，可供選擇的商業(yè)化探針也越來越多。但是，由于目前儀器設(shè)備和探針價格過于昂貴，以及對于操作人員技術(shù)水平要求也較高，在一定程度上限制了FISH技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。特別是在我國，僅有一些大醫(yī)院開展了FISH項目，檢測范圍也于血液性腫瘤、乳腺癌以及產(chǎn)前診斷方面，其他檢測項目開展較少。因此，在今后的一段時間，為了使FISH得到更廣泛的應(yīng)用，怎樣降低成本，簡化操作步驟仍是科研人員面臨的一個難題。